جستجوی پیشرفته

   
 
Home ثبت نام پرسشهاي متداول ليست اعضا گروههاي کاربران  
 
 
براي تغيير زبان صفحه كليد EN/FA از كليد Scroll Lock بر روي صفحه كليد استفاده نماييد.
فهرست تكنيك ها و روشهاي تشخيص تكنيكهاي تشخيصي بيماري تيلريوز
نمايش پستها:   
      تمام زمانها بر حسب GMT + 4 Hours مي‌باشند  
  ارسال موضوع جديد  پاسخ دادن به اين موضوع

20 خرداد 1384 - 23:52
نويسنده پيام
nima
كاربر بسيار فعال
كاربر بسيار فعال


عضو شده در: 4 خرداد 1384
پست: 816

عنوان: تكنيكهاي تشخيصي بيماري تيلريوز پاسخگويي به اين موضوع بهمراه نقل قول

تيلريا انگل تك ياخته أي اجباري داخل سلولي تمام خانواده گاوهاي وحشي و اهلي ( Bovidae ) در جهان ميباشد. و بعضي از گونه ها نشخواركنندگان كوچك را نيز مبتلا مي نمايد. بوسيله كنه هاي خانواده Ixodidae منتقل ميشوند و داراي زندگي پيچيده اي در مهره داران و بي مهره ها ميباشند. شش گونه تيلريا گاو را آلوده ميكند كه دو تا از آنها بيماري زايي بيشتري دارند : اولي بنامT. parva كه بيماري East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ايجاد و دومي T. annulata باعث بيماري Tropical theileriosis ميشود.

ديگر گونه ها كه شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans هستند معمولا بيماري زايي خفيفي ايجاد ميكنند. گونه T. velifera غير بيماري زا است. اغلب اين گونه ها پس آلوده كردن دام ايجاد دام ناقل در دامهاي بهبود يافته را مينمايند اما هيچ نوع داده وآماري در رابطه با رل اين ناقلين در انتقال بيماري در حالت طبيعي وجود ندارد.

گاوهاي بومي درمناطق بومي آلوده ممكن است بيماري را تحمل نموده و يا به بيماري خفيف و تحت كلينيكي مبتلا شوند. اما گاوهاي غير بومي حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شديدي نشان داده و يا تلف مي شوند.

همانطوريكه قبلا هم گفته شد شيزونت ها در گسترش تهيه شده از غدد لنفاوي مشخصه خوبي براي آلودگي با T. parva, T. annulata ميباشد. شيزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آميزي شده بوسيله گيمسا بخوبي قابل تشخيص نميباشد.

شيزونت T.mutans نسبت به شيزونت T. parva داراي هسته هاي بزرگتر، مسطح وبي قاعده ميباشد.

فرم پيروپلاسمي T. parva , T. annulata و T. mutans شبيه بهم ميباشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسيم ديده ميشود. T. velifera ممكن است بوسيله يك پرده حجاب مانند تشخيص داده شود.



تشخيص سرولوژيكي :

تشخيص وجود پادتن بصورت غير مستقيم بوسيله IFA ( indirect fluorescent antibody)

بطور گسترده براي تشخيص گونه هاي مختلف تيلريا بكار مي رود. تشخيص نوع آلودگي بخصوص آلودگي با ‍T. parva چندان در بين روشهاي ايمنولوژي قابل تمايز نمي باشد. بهترين روش سرولوژي قابل تمايز مابين گونه هاي تيلريا آزمايش غير مستقيم پادتن فلورسانس IFA ( Indirect Fluorescent Antibody ) مي باشد. در اين آزمايش هر دو مرحله شيزونت و پيروپلاسمي بوسيله لام تهيه شده و يا در محلول قابل بررسي مي باشند. براي نگهداري محلول يا لامهاي تهيه شده در مرحله شيزونتي دماي انجماد (20- تا 70- ) استفاده ميشود ولي در مرحله پيروپلاسمي براي نگهداري محلول از دماي 4 درجه يخچال و براي لامها از دماي انجماد ميتوان استفاده كرد.

سرمهاي مورد آزمايش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقيق ميكنند و با محلول آنتي ژني در انكوباتور ميگذارند و بعد ضد ايمنوگلوبولين متصل گاوي anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده ميشود.



الف- تهيه لام يا اسلايد آنتي ژن شيزونت

آنتي ژن مورد استفاده براي schizont IFA test ازتيره سلولي شيزونت ليمفوبلاستوئيد Lymphoblastoid گرفته ميشود. كشتهاي سلولي را كه داراي رقت 200 ميلي ليتر شيزونت در يك ليتر شيزونت هاي آلوده ( به T. parva ويا T. annulata بوده و حاوي ده ميليون سلول در هر ميلي ليتر و حداقل 90% سلولها آلوده ميباشند ) باشد را سانتريفيوژ كرده ( بمدت 20 دقيقه در سرعت 200 دور در دقيقه در دماي 4 درجه ) و مايع روئي را دور ريخته و سلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دماي 4 درجه و pH 7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتريفيوژ ميكنيم. اين روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرين با رسلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائي حدودCELL/ML 7 10 درآيد.

گسترش نازك از محلول سلولي را روي اسلايد حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهيه كرده ويا روي لام معمولي را با استفاده از لاك ناخن تقسيم كنيم . هر گسترش بايد داراي 50 تا 80 سلول سالم در هر ديد ميكروسكوپي Field ‌باشد (‌وقتيكه با بزرگنمايي 40 با روغن Immersion بررسي شود) .بوسيله پي پت 100μl آنتي ژنها را با مكش يكدفعه روي لام ريخته كه پس از توزيع محلول شيزنت يا پيروپلاسم يك لايه Monolayer در هر كدام باقي مي ماند. اينكار را براي هر حفره انجام داده تا مايع تمام شود. بااين روش تقريبا“‌مي توان 600لام با كيفيت خوب كه حاوي 6 هزار سلول در هر نقطه آنتي ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقيقه ثابت كرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال كاغذي پيچيده و سپس در كاغذ آلومينيم (‌فويل آلومينيم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردماي20- درجه سانتيگراديا 70 - درجه سانتيگراد نگه مي داريم . دردماي –20 درجه سانتيگراد بمدت يكسال قابل استفاده هستند ودردرماي –70 درجه سانتيگراد بمدت طولاني تر (‌دردماي يخچال 4 درجه سانتيگراد بمدت چهارماه قابل نگهداري هستند).



ب- محلول آنتي ژن شيزونت

ابتدا 500 ميلي ليتر از محلول T.annalataيا T. parva سلولهاي آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانترفيوژكرده (‌در 150 g دور دردقيقه براي ده دقيقه در دماي 4 درجه )‌ وسلولهاي ته نشين شده در100سي سيPBS سرد دوبار شستشو مي دهيم.

قابليت زنده بودن سلولها را بوسيله اوزين Eosin يا Trypan blue بررسي ميشود (‌كه بايد بيش از %90‌باشد )‌محلول سلولها بايد درمحلول سرم فيريولوژي سرد رقيق شود تا غلظت 7 10سلول (/ml Cell) بدست آيد دراين حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوي 80%‌ استن و 0.1 % فرمالين در PBS قطره قطره اضافه كرده (‌در درماي –20 درجه )‌تا درمدت 24 ساعت به تثبيت رسد.

سلولهاي ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فيولوژي سرد شده دردماي 4 درجه ) و‌در 200 دور دردقيقه بمدت 20 دقيقه سانترفيوژ ميكنيم. بعد از آخرين شتشو سلولهاي ته نشين شده را در سرم فيولوژي رقيق كرده تا غلظت 107/ml بدست آيد . بميزان 5/0 سي سي سلولهاي ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسيم مي كنيم .



تهيه اسلايد حاوي آنتي ژن پيروپلاسم:

مرحله پيرپلاسمي گونه هاي تيلريا را نمي توان دركشت سلول نگهداري يا تهيه نمايند. زيرا آنتي ژن پيروپلاسمي بايد از حيوانات زنده آلوده تهيه شود و عفونتهاي تجربي بوسيله تزريق زير پوستي با اسپروزئيت يا كنه هاي آلوده باT.parva T.taurotragi ,T.annulata , صورت ميگيرد. آلودگي گروه انگلي T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسيله تزريق داخل رگي خون حيوان ناقل به گاو يا گوساله طحال برداشته و يا تماس با كنه آلوده ايجاد مي شود. وقتيكه آلودگي پيروپلاسمي بيش از 5% ‌باشد، صد ميلي ليتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبي با PBS مخلوط مي كنيم . اين مخلوط را سانترفيوژ كرده (‌با500دور در دقيقه براي ده دقيقه)‌ و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا كرده و RBC هاي باقي مانده را بادوليتر PBS رقيق مي كنيم. سپس دوباره سانترفيوژ كرده وهمينطور Buffy coat را جدا ميكنيم . اين عمل رابراي چهار بار تكرار مي كنيم و بعد از پنجمين ششتشو، مقداري از RBC هاي جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط كرده واز آن 5μl روي هر اسلايد مي گذاريم. نقاط خشك شده را با متانول تثبيت كرده وبا رنگ آميزي گيمسا رنگ ميكنيم ونهايتا زيرميكروسكوپ نوري بررسي مي كنيم . تقريبا ده هزار اسلايد آنتي ژني (‌صد هزار نقاط آنتي ژن ) ا ز100سي سي خون آلوده‌ تهيه مي شود. اسميرهاي آنتي ژني را در دماي اتاق خشك كرده وبعد در دماي 4 سانتيگراد درجه در استن بمدت ده دقيقه فيكس ميكنيم. اسميرهاي فيكس شده شبيه اسلايدهاي آنتي ژني شيزونت نگهداري ميشوند.



محلول يا سوسپانسيون حاوي پيروپلاسم :‌

يك روش تهيه آنتي ژن براي T.parva قبلا“‌شرح داده شد دراين روش صد ميلي ليتر از خون حيوانيكه شديدا“‌ در مرحله آلودگي پيروپلاسمي باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهاي قرمز تجمع كرده را به PBS اضافه كرده تا محلول 5%‌ بدست آيد.- در مراحل فوق بايد آنتي ژن را استانداردكرد-

تهيه lysate‌Bovine Lymphocyte : اين ماده طبق روش Godderis et al. براي بررسي محلول آنتي ژن T. parva بكار مي رود . ابتدا يك گوساله سه ماهه كه طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طريق تماس با كنه و يا پشه تسه تسهtse Tse آلوده مي كنيم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آميزي گيمسا بررسي ميكنيم . نهايتا بعد از مرگ يا كشتن حيوان از تيموس و غددلنفاوي نمونه برداري مي كنيم .

بافتها را به قطعات كوچكتر تقسيم كرده ودر PBS سرد ( در دماي 4 درجه) بهمراه %45 /.0 مواد ضد انعقاد نگهداري ميكنيم . سلولها را از بافت بوسيله پارچه MUSLIN جدا كرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTA ميدهيم و در دور 200 بمدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتريفيوژ ميكنيم . لينفوسيتهاي شسته شده را با PBS كه عاري از EDTA باشد، مخلوط مي كنيم تا غلظت نهائي CELL/ML 107*5 بدست آيد .

روش كار براي تشخيص آنتي بادي فلورسانس :‌

اسلايد شيزونت يا پيروپلاسم را از دماي انجماد، 20- درجه سانتيگراد در آورده و بمدت 30 دقيقه در دماي يخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقيقه ديگر در دماي اتاق ميگذاريم.

بوسيله پي پت پاستور 100/μl آنتي ژن را روي هر لام ريخته ودردماي اتاق 37 درجه خشك مي كنيم . ميتوان براي تلعلع بهتر وديد بهتر از Evansblue نيزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده كرد و بعد در گلسيرول 50% در pH 8 ميگذاريم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولاني تر و عميق تر اثر گذارد . اسلايدهاي تهيه شده تا 72 ساعت در دماي 4 درجه د رتاريكي قابل نگهداري و استفاده ميباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئيت ها آنتي بادي هاي توليد شده بر عليه T.parva و T.annulate ابتدا" بين روزهاي دهم تا 14 برعليه شيزونت ودر بين روزهاي 15-21 بر عليه پيروپلاسم قابل تشخيص مي باشند. پادتنها بعد از بهبودي ناپديد مي شوند ووابسته به فاكتورهاي متفاوتي از جمله وضعيت ناقل، ‌فاصله مابين درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با كنه آلوده تغيير مي كنند. معمولا“ ‌4 تا 6 ماه بعد از آلودگي آنتي بادي پائين مي آيد (‌در صورتيكه تماس دوباره پيش نيايد).

بدنبال آلودگي با T.mutans آنتي بادي در روزهاي دهم تا 15 قابل اندازه گيري بوده و بعد از 12-24 ماه پائين ميآيد.
 
      Back To Top  

6 مهر 1385 - 12:43
نويسنده پيام
دكتر محمد لطفي زاده
كاربر بسيار فعال
كاربر بسيار فعال


عضو شده در: 6 مهر 1385
پست: 202

عنوان: آزمايش و تشخيص در قلب روستا ..... پاسخگويي به اين موضوع بهمراه نقل قول

با سلام و احترام

با تشكر از مطلب خوب شما

با توجه به آنچه توضيح داديد فكر مي كنيد بهترين روش براي تشخيص تيلريوز در سطح فارم چيست؟


در يك روستا كه هيچ امكان آزمايشگاهي وجود ندارد مهمترين كار براي تشخيص تيلريوز چيست؟
 
      Back To Top  

8 مهر 1385 - 12:34
نويسنده پيام
nima
كاربر بسيار فعال
كاربر بسيار فعال


عضو شده در: 4 خرداد 1384
پست: 816

عنوان: پاسخگويي به اين موضوع بهمراه نقل قول

علائم كلينيكي
گستردگي ناقلين يا كنه ها
بررسي لامهاي تهيه شده ( گسترش خون و يا گسترش غدد لنفاوي)
 
      Back To Top  

8 مهر 1385 - 15:55
نويسنده پيام
دكتر محمد لطفي زاده
كاربر بسيار فعال
كاربر بسيار فعال


عضو شده در: 6 مهر 1385
پست: 202

عنوان: در قلب روستا ......!!!! پاسخگويي به اين موضوع بهمراه نقل قول

با سلام و احترام

ضمن تشكر از پاسخ خيلي خوب شما و هوشياري در اولويت بندي پاسخ

بايد عرض كنم در يك روستا اگر هيچ امكان آزمايشگاهي وجود نداشته باشد و حتي بررسي لامها ممكن نباشد (بخصوص كه پونكسيون غدد لنفاوي خيلي هم هميشه موفقيت آميز نيست و فقط در مرحله خاصي از بيماري كمك كننده است) بهترين راه تشخيص بيماري ولو اينكه كنه هم روي بدن دام يافت نشود تست تراپي است. استفاده از داروي بوتالكس در اين مواقع و با توجه به فصل شيوع بيماري كه فصل گرم سال است بسيار كمك كننده است.
 
      Back To Top  
   ارسال موضوع جديد  پاسخ دادن به اين موضوع

 
شما نمي توانيد در اين بخش موضوع جديد پست كنيد
شما نمي توانيد در اين بخش به موضوعها پاسخ دهيد
شما نمي توانيد موضوع هاي خودتان را در اين بخش ويرايش كنيد
شما نمي توانيد موضوع هاي خودتان را در اين بخش حذف كنيد
شما نمي توانيد در اين بخش راي دهيد


      Back To Top  

صفحه 1 از 1
   
Powered by Ardalan Online © 2004,2005
پشتيباني توسط : مؤسسه پارس نگار